提取组织器官rna|净信多样品组织匀浆机实验案例-腾博游戏官网手机版

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2020/12/21 12:03:21
提取组织器官rna|净信多样品组织匀浆机实验案例
来源:上海净信

组织样品中rna的提取实验:本实验的组织样品主要有小鼠的各个组织器官(如肝脏,肌肉,脂肪等)和人肿瘤标本(如结直肠癌,肺癌,乳腺癌)

1.首先要根据需要抽提的组织样品的质量加入相应的trizol液体,同时加入若干颗不锈钢柱。本实验室一般情况如下:(小鼠组织加入trizol,结直肠癌标本加入trizol)

注意:

a.用净信匀浆机进行匀浆处理时样品体积最好不要超过trizol体积10℅)

b.需事先预冷试管座

2.把加入样品,trizol,不锈钢柱的axygene ep管放入事先预冷好的试管座中。机器设置好参数盖上盖子,点击运行

3.机器运行完毕后,打开盖子,拿出净信ep管仔细观察组织的研磨情况,如果没有明显的块状物,那就可以进入下一步实验步骤,如果没有完全打碎,还需要把ep管放入试管座中,继续匀浆。有些坚硬,或者脂肪含量高的组织(乳腺)可能需要稍微长一点的时间,时间可以依据组织实际的研磨情况来调整匀浆时间。

4.和传统的trizol提取rna的方法一样,将匀浆样品在室温放置几分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。

5.每使用1ml trizol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡若干秒,室温放置几分钟。

6.2-8℃10000×g离心十几分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。

7.把水相转移到新管中,如要分离dna和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的rna。每使用1ml trizol加入异丙醇,室温放置几分钟。

8.2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出rna沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

9.用75℅乙醇洗涤rna沉淀。每使用1ml trizol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心几分钟,弃上清。

10.室温放置干燥或真空抽干rna沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致rna的溶解性大大降低。加入无rnase的水,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使rna溶解.如rna用于酶切反应,勿使用sds溶液。

常见问题分析:

1得率低:

a.样品裂解或匀浆处理不彻底

b.rna沉淀未完全溶解

c.检测吸光度时,rna样品没有溶于水,而溶于了te中。低离子浓度和低ph值条件下a280值偏高

d.样品匀浆时加的试剂量太少

e.匀浆样品时未在室温放置几分钟

f.吸取水相时混入了有机相

2 rna降解

a.组织取出后没有马上处理或冷冻

b.待提取rna的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

c.细胞在用胰酶处理时过度

d.溶液或离心管未经rnase去除处理

e.电泳时使用的甲醛ph值低于了3.5

3 dna污染:

a.样品匀浆时加的试剂量太少

b.样品中含有有机溶剂(如乙醇,dmso等),强缓冲液或碱性溶液

预防rnase污染注意事项:

1.经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为rnase的来源。

2.使用灭过菌的rna专用塑料制品避免交叉污染。

3.rna在trizol试剂中时不会被rnase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含rnase的塑料和玻璃器皿。

4.配制溶液应使用无rnase的水

本实验已经研磨的各个组织中发现肝脏组织是最容易研磨,研磨效率是最好的。

下图a是rna经过传统的液氮研磨和匀浆器研磨法抽出的rna跑胶图,结果很明显发现这种方法是可行的,是可以代替传统的方法的。

下图b是利用组织匀浆器对小鼠的各个组织进行匀浆抽出的rna跑胶图。发现在抽提各个组织的rna的时候也是可行的。

图c是利用组织匀浆器对人结肠癌标本进行了研磨后抽提出的rna的跑胶图。

图d是小鼠的肝脏组织经过手工研磨和机器匀浆后,最后抽提得到的rna进行了浓度的测定,结果说明组织匀浆器抽提出得rna的浓度要显著高于传统的手工的方法得到的rna。

蛋白质的提取

a.根据需要抽提的组织样品的质量加入相应的蛋白质裂解液(如ripa),同时加入3颗不锈钢柱。(小鼠肝脏组织加入1mlripa蛋白裂解液,人结直肠癌组织加入500ulripa蛋白裂解液)

b.把加入样品,蛋白裂解液,不锈钢柱的axygene ep管放入事先预冷好的试管座中。机器设置好参数盖上盖子,点击运行。

以下同上rna的操作方法

最终所得到的蛋白质浓度的测定经过bca试剂盒测定完成的,同时通过sds-page后经过考马斯亮蓝染色和western blot检测都发现其要比传统的方法更加简便快捷,不容易引起交叉污染。

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